در این آزمایش  راه‌حل ساده‌ای برای استخراج DNA از موز شرح می‌دهیم،

اگرچه شما حتی می‌توانید با میوه‌ها وسبزیجات دیگر هم این آزمایش را انجام دهید.

این آزمایش هم در خانه و هم در آزمایشگاه مدرسه قابل اجرا است.

چگونه از میوه DNA استخراج کنیم؟

 

در سال‌هاى اخیر غیر عادى نیست که درباره‌ی DNA ، مطالبی در مجله‌هاى علمی یا عمومی بخوانیم. DNA) Deoxyribonucleic Acid) که این روزها مدام ازآن یاد می‌کنند مولکول بلندی است که اطلاعات ‍‍ژنتیک را درتمام موجودات زنده اعم از گیاه، جانور، یا میکرو‌ارگانیسم‌های  ساده نگهدارى می کند. این مولکول قادر به کپی کردن خود وسنتز RiboNucleic Acid)RNA) است.در فرم‌های پیچیده‌تر حیات، DNA در هسته‌ی سلول قرار دارد. بجز در سلول‌های قرمز خون پستانداران که تهی از هسته است، هر موجود زنده داراى DNA مخصوص به خود است.سلول‌هاى هر ارگانیسم قسمت‌های معینی از مولکول DNA یا ژن‌ها را مورد استفاده قرار می‌دهد تا پروتئین‌هاى مورد نیازعملکرد خود را بسازند.   در این آزمایش من راه‌حل ساده‌ای برای استخراج DNA از موز شرح می‌دهم، اگرچه شما حتی می‌توانید با میوه‌ها وسبزیجات دیگر هم این آزمایش را انجام دهید.این آزمایش هم در خانه و هم در آزمایشگاه مدرسه قابل اجرا است.

 

 

خلاصه ى روش کار:

روشى که در زیرشرح داده خواهد شد بر گرفته از این حقیقت است که غشای خارجی سلول‌ها وغشای هسته ازترکیبات چربى ساخته شده که می تواند بوسیله‌ی یک شوینده‌ی ساده شکسته شود.
در این روش ابتدا میوه را بصورت تفاله در آورده بطوری که سلول از هم جدا می شود و بدین ترتیب راحت‌تر در مقابل تأثیر شوینده قرار می‌گیرد.
در مرحله دوم شوینده به تفاله میوه اضافه می شود تا DNA از غشای سلول‌ها که بصورت کپسول آن را احاطه کرده آزاد شود.
در سومین مرحله لازم است که بوسیله صافی نوکلئیک اسید را از باقیمانده غشای سلولی جدا کنیم.
در نهایت DNA در الکل رسوب می‌کند و قابل مشاهده می‌شود .
DNA ای که شما به این روش به دست می‌آورید بوسیله‌ی میکروسکوپ قابل مشاهده است ومی‌توان برای آزمایش‌هاى دیگر نظیر الکتروفورز از آن استفاده کرد.

مقدمات آزمایش:

مواد لازم:

- دیگ کوچک
- دماسنج
- کاسه‌ى پلاستیکی
- تکه‌هاى یخ
cc -50 ایزوپروپیل 95-70% یا الکل تقلیبى (اتانول) در یک بطری در بسته
 - پارچه کهنه و دستمال کاغذى

 

روش کار:

یک روز قبل از آزمایش مقداری یخ قالبی آماده کنید.
حداقل 2 ساعت قبل cc 50 از ایزوپروپیل یا اتانول تقلیبی 95-70% رادر یک بطری  پلاستیکی در بسته بریزید وآنرا در فریزر قرار دهید.(از محکم بودن در بطری مطمئن شوید چرا که بخار الکل قابل اشتعال است)
15 دقیقه قبل از شروع آزمایش یک دیگ کوچک آب را تا c  60ْ  گرم کنید.

 

آماده‌سازی محلول استخراج:

 

همانطور که قبلاً اشاره شد،DNA در داخل هسته‌ى سلول‌هاى میوه قرار دارد.برای آزاد کردن DNA‌ لازم است که غشاهاى سلول‌ها وهسته‌های آنها تخریب شود.از آنجا که این غشاها از فسفولیپید ساخته شده اند ، که مولکول‌هایی غنی از چربی هستند، ما آنها را بوسیله‌ى یک شوینده‌ى خانگی ساده حل می‌کنیم. همچنین از کمی نمک خوراکی استفاده می‌کنیم.این نمک کمک می‌کند پروتئین‌هایی به نام هیستون که DNA روی آنها پیچ خورده حذف شوند.

مواد لازم:

 

 

- cc 100 آب مقطر(آب معمولی نیز می‌توان استفاده کرد)
- ترازو برای اندازه‌گیری وزن (در صورت امکان)
- 3 گرم نمک خوراکی (نصف قاشق چایخوری)
-  cc10 شوینده‌ی مایع 
-1عدد سرنگ cc 10 بدون سر سرنگ
- یک بشر cc100 
- میله‌ی شیشه‌ای

روش کار:

مقدار 3 گرم نمک وcc 80 آب مقطر را در یک بشر cc 100 بریزید.آنها را مخلوط کنید تا نمک کاملا ً حل شود.
به وسیله سرنگ، cc 10  از مایع شوینده بردارید و به محلول اضافه کنید.
آب مقطر اضافه کنید تا کل محلول به حجم  cc100    برسد.
محلول را طوری مخلوط کنید که حباب ایجاد نشود و یک محلول یکنواخت (هموژن) حاصل شود.
محلول استخراج آماده است.

 

آماده‌سازی تفاله:

 

این عمل برای جدا کردن سلول ها از یکدیگر  بکار می رود و برای تأ‌ثیربهتر محلول استخراج روی سلول ها لازم است.

مواد لازم:

-  gr 100 موز( یا  کیوى، سیب ، گلابی، خرمالو،نخود فرنگی، پیاز وغیره)
- ترازو
- چاقو
- تخته آشپزخانه و چنگال
- بشر cc 250
- قاشق چایخوری

روش کار:

100 گرم موز(بدون پوست) را روی تخته‌ی آشپزخانه قرار می‌دهیم وبوسیله چنگال آن را له می‌کنیم تا یک خمیر یکنواخت به دست آید.اگر پیاز استفاده می‌کنید بوسیله چاقو مکعب‌هایی به ضلعmm  5 یا کمتر جدا کنید. شما می‌توانید از هاون یا مخلوط کن هم استفاده کنید. درصورت استفاده از آنها گوشت میوه(تفاله) را زیاد خرد نکنید.
تفاله را در بشر cc 250 بریزید. 

 

 

استخراج DNA :

 

هدف از این عمل تخریب سلول‌ها و هسته‌های آنها برای آزاد کردنDNA است.
تفاله (گوشت میوه) تا c  60ْ  گرم می‌شود تا به روند تخریب سلول‌ها سرعت بخشد.

گرم کردن تفاله همچنین به غیر فعال شدن آنزیم‌هاى DNAase  که مقدار DNA را کم می‌کند، کمک می‌کند.هر چند اگرتفاله میوه را  به مدت طولانی در دمای بیشتری نگه دارید،DNA شروع به قطعه قطعه شدن می کند. به همین خاطر توصیه می‌شود که تفاله را بعد از 15 دقیقه در یک حمام آب خنک (ظرف پلاستیکی حاوی یخ) قرار دهید.

مواد لازم: 

- دماسنج
- دیگ حاوی آب c  60ْ  
- کاسه‌ى پلاستیکی حاوی یخ و آب

 

 

روش کار:

محلول استخراج را در تفاله بریزید.
بشر را در بن ماری (دیگ حاوی آب) c  60ْ   قرار دهید.
تفاله را بهم بزنید تا محلول استخراج پخش شود و دما یکنواخت گردد.
بعد از 15دقیقه بشر را در بن ماری دارى یخ قرار دهید. مخلوط را بهم بزنید تا یکنواخت شود.
بعد از 5 دقیقه بشر را خارج کنید و خود را برای مرحله بعد آماده کنید.

صاف کردن:

:
مرحله صاف کردن برای جمع‌آوری مایع حاوی DNA و جدا کردن آن از باقیمانده‌های سلولی ودیگر بافت‌هاى میوه که دور ریخته می‌شوند انجام می‌شود.

 

مواد لازم:

 

 

- الک با قطر حدود cm 12 
- کاغذ صافی قهوه (مخصوص دستگاه قهوه‌ساز)- کاغذ صافی آزمایشگاه بسیار ضخیم است- کاغذ‌خشک‌کن آشپزخانه هم می‌تواند بکار رود، مشروط به اینکه سوراخ قابل دید نداشته باشد.
- کاسه

روش کار:

الک را روی کاسه قرار دهید.
یک کاغذ صافی بردارید و آنرا خیس کرده روى الک بگذارید.
مقداری تفاله بردارید و آنرا روی کاغذ صافی بگذارید. مراقب باشید تا تمام مواد ازبین کاغذ صافی عبور کند.
آنرا به آرامی بهم بزنید تا به روند صاف کردن کمک کند و مراقب باشید تا کاغذ صافی کنار نرود.
مایعی که بدست خواهید آورد حاوی DNA  است.

 

جدا کردن پروتئین: (اختیاری)

 

بوسیله این عملیاتِ اضافه، شما می‌توانید یک عصاره‌ی خالص DNA داشته باشید ولی برای دیدن

DNA ضروری نیست. به خاطر اینکه DNA به دور پروتئین‌هایی به نام هیستون پیچیده شده، برای به دست آوردن DNA خالص باید این پروتئین‌ها را جدا کنید. برای جدا کردن هیستون ها شما می‌توانید از آنزیم‌های پروتئولیتیک مانند پروتئاز استفاده کنید. شما می‌توانید آنزیم پروتئاز را از مغازه‌ای که مواد شیمیایی و آزمایشگاهی می‌فروشد، تهیه کنید یا می‌توانید آن را به وسیله ماده دیگری جایگزین کنید که بسیار راحت‌تر پیدا می شود، این ماده در آب آناناس پیدا می‌شود که حاوی بروملائین است. ماده‌ای که می‌تواند پروتئین‌ها را به آمینو اسیدهای سازنده‌شان تجزیه کند. 

مواد لازم:

 

 - آنزیم پروتئولیتیک (مثل پروتئاز یا آب آناناس- آب آناناس را از میوه‌ی  آناناس تهیه کنید)
- یک سرنگ cc 5 بدون سر سرنگ
روش کار:
در یک لوله آزمایش cc 5 از مایع شوینده بریزید.
cc 1آب آناناس بریزید ومخلوط کنید.
3-2 دقیقه صبر کنید تا پروملائین اثر خود را بگذارد.

 

رسوب دادن DNA:

 

DNA مقداری در آب محلول و غیر قابل دیدن است. در حالی که در الکل نا‌محلول است و در آن رسوب کرده و قابل دیدن می شود. با اضافه کردن الکل به محلول، صاف شده‌ی DNA  در لوله آزمایش  DNA ظاهر می شود.

 مواد لازم:
 - تعدادی لوله آزمایش برای تکرار آزمایش
- گیره
- الکل سرد (الکلی که مدتی در فریزر بوده است)

روش کار:

 

 

- به آرامی! مقداری از الکل سرد را داخل لوله آزمایش مرحله‌ی قبل می‌ریزیم به‌طوری‌که با محلول صاف شده مخلوط نشود. 
- حجم الکل باید با حجم محلول برابر باشد.
- بگذارید لوله آزمایش 5 دقیقه ساکن بماند تا DNA رسوب کرده و در لوله جمع شود.

 

اکنون در نقطه‌ی تماس الکل و محلول صاف شده شما قادر به دیدن ماده‌ای شیری رنگ هستید که با گذشت زمان به حجم آن اضافه می‌گردد. این ماده‌ی شیری DNA موز است. متاسفانه در این توده‌ی شیری کوچک شما تعداد زیادی حباب کوچک مشاهده می‌کنید. وجود این حباب‌ها به این دلیل است که حل‌پذیری گازها در مایعات سرد بیشتر از مایعات گرم است. هنگامی که الکل در فریزر است مقداری گاز را جذب می‌کند که با گرم شدن مایع این گازها آزاد می‌شوند.

 













 

 

 

مشاهده با میکروسکوپ(اختیاری)

 

مواد لازم:

 

 

- لام تمیز میکروسکوپ
 - یک قلاب که بوسیله مفتول فلزی ساخته شده
- رنگ براى رنگ‌آمیزی هسته (تولوئیدن، متیلن بلو، استواورسئین)
- قطره چکان
- میکروسکوپ

روش کار:

بوسیله یک مفتول فلزی قلاب‌دار مقداری از DNA را از داخل لوله آزمایش خارج کنید و آنرا روى لام تمیز قرار دهید.توده‌ى را روى لام با رنگ هسته رنگ‌آمیزی کنید.اگر لازم است یک قطره کوچک آب اضافه کنید و لامل را روی آن قرار دهید.با مشاهده آن زیر میکروسکوپ انتظار نداشته باشید که نردبان دوبل-هلیکس DNA را ببینید. شما حتی به کمک میکروسکوپ الکترونی هم نمی‌توانید آن را ببینید. چیزی که خواهید دید انبوهی از توده‌ى DNA است که شبیه رشته‌هاى به هم پیچیده‌ى پروتئین است.

 

نتیجه‌گیری:

 

 انجام آزمایش آن قدر هم سخت نبود.بود؟ 
هدف از این آزمایش ساده، آماده کردن شما برای آشنایی با روش‌هایی است که در زیست‌شناسی مولکولی به کار می‌رود. اغلب تکنیک‌های مورد استفاده در آزمایش‌های میکروبیولوژی مدرن ساختار ساده‌اى شبیه این دارند. در مواردی هم پروسه تا حدودی پیچیده‌تر می‌شود و نیاز به تجهیزات بیشتری دارد.در همه‌ی این موارد داشتن دانش ضمنی درباره‌ى زیست وشیمی ضرورى است. این آزمایش برای علاقمند کردن شما برای کشف‌هاى آینده است.